一，试剂盒组份

组份	P0065(20T)	P0065(50T)	P0065 (100T)
5×Lysis Buffer	40 mL	100 mL	2×100 mL
2.5M CaCl2	25mL	60mL	120mL
Store Buffer	6mL	15 mL	30mL

本试剂盒可用于从植物叶片中分离出内质网。提取内质网一般有密度梯度离心、氯化钙沉淀和超速离心等方法，本试剂盒采用氯化钙沉淀法提取。此方法操作简单，对离心机要求不高，所得内质网纯度一般。对于一些根尖等嫩生组织也可提取。

准备工作：将5×Lysis Buffer用双蒸水稀释成1×Lysis Buffer（1体积5×Lysis Buffer加入4体积的水混匀，稀释后可保存一个月），根据用量，将2.5M CaCl2稀释成8mM CaCl2(取800ul浓缩液稀释成250ml，现配现用，保存不超过48小时)，将稀释好的1×Lysis Buffer和8mM CaCl2  2-8℃存放。准备冷的PBS或者生理盐水。

1. 样本处理及匀浆：叶片用蒸馏水清洗2-3次，滤纸吸干，有条件请用液氮研磨叶片4-5克，研磨完后，取3g左右研磨的叶片粉，加入10ml预冷的1×Lysis Buffer，混匀。如果无条件（无液氮），请预冷研钵，取洗过的叶片3g，用剪刀剪为碎块放入玻璃匀浆器或者研钵中。加入适量的1×Lysis Buffer，冰上研磨至看不见明显组织块，再补充1×Lysis Buffer到10ml，混匀。

2. 将匀浆物转移到合适的离心管，4℃，1000× g离心5 min。

3．取上清，加入一新的离心管中，4℃， 12,000 × g 离心10 min。沉淀有线粒体，可从中提线粒体蛋白。

4．将上清测体积并转移到合适的烧杯中，边搅拌边慢慢加入15倍体积的预冷的8mM CaCl2，加完后再次4℃搅拌15 min。

6. 将上步的混合物分装入合适的离收管中，4℃，8000× g 离心10 min。

7．弃上清，内质网在沉淀中。

8. 用100-200μL Store Buffer 或合适的缓冲液重悬内质网沉淀，立即使用或-70℃保存。

附：如果实验室有条件，可以从第3步结束后的上清，采用100 000× g（十万G）  4℃离心60 min也可得到内质网沉淀，两种方法得到的内质网组分并不完全相同。氯化钙沉淀法主要为粗面内质网，超速离心为全内质网。

 

1. 为保证获得完整的内质网，第一是全程低温操作。第二是快速。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备内质网的最关键环节。

2. 本试剂盒可以等比减少样本和试剂用量，比如一次用500mg样本，各试剂一次只用到十分之一，但结果可能是内质网提得的量特别少，以至后期实验无法展开。

3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入上样缓冲液裂解内质网。

五 储存：本试剂盒可4℃储存一年。