去内毒素质粒DAN提取试剂盒

试剂盒组成	50T	200T	保存温度
RNaseA（10mg/ml）	400ul	2ml	-20℃
溶液Ⅰ	10ml	40ml	RT
溶液Ⅱ	10ml	40ml	RT
溶液Ⅲ	10ml	40ml	RT
内毒素清除剂	25ml	100 ml	2-8℃
结合液	30 ml	120 ml	RT
玻璃奶	1ml	4ml	RT
TE缓冲液	10ml	30ml	RT

原理简介

本试剂盒在常规质粒提取试剂盒的基础上改进而来，增加内毒素清步骤，提取的质粒可用于一些要求更高的实验，如转染。
本试剂盒（以200T为例）可以用200小次或者10大次提取。

注意事项
1．溶液Ⅱ低温时可能出现析出和沉淀，可以37度水浴几分钟即可恢复澄清透明。用完请及时盖紧盖子。
2．溶液Ⅰ中加入RNase 后请放2-8度保存，如果长久不用（如一个月），可-20度冻存，或者按照比较分次加入。
3．可根据实验情况中量或者大量提取，加入的试剂等比放大。
4．内毒素清除剂在常温下出现面混浊现象，为正常，在2-8℃放置一段时间混浊会消失。
5．本试剂盒在去除内毒素的过程中会损失少量质粒，因而相对于常规提取，本试剂盒得率偏低。

操作步骤(以小量提取为例,中提或者大提可等比例加入)
在溶液Ⅰ中加入RNaseA，混匀，2－8度保存。
1．取过夜菌1-5毫升，5000g离心1分钟收集细菌沉淀，弃上清（可重复多次收集于一管中，收集量可考虑菌液浓度与质粒拷贝数），如为阳性细菌，可加入100mg/ml的溶菌酶悬浮菌液，37度处理30分钟，离心，收集沉淀。
2．在收集的菌液中，加入200ul溶液I，重悬细菌沉淀。确保沉淀完全散开，无可见细菌团块(可vortex 5-10秒或更长时间)。室温放置2-3分钟。
3．每管加入200ul溶液Ⅱ（如有沉淀，可37度水浴），轻轻颠倒离心管4-6次，使细菌完全裂解，溶液透明。放置2-3分钟，不过超过5分钟。但也不要混匀后立刻加入溶液Ⅲ。
4．放置2-3分钟后，每管加入200ul溶液III，随即颠倒离心管4-6次混匀，可见白色絮状物产生。
5．最高速(13,000rpm左右)室温离心5分钟。
6．将上清转移到新的离心管中，如有沉淀，可再次离心。
7．加入上清1/5体积冰预冷的内毒素清除剂，振荡混匀，溶液变浑浊，冰浴2min至溶液变清亮。
8．37℃水浴2min，不时振荡，溶液又变浑浊。12000rpm室温离心2min，溶液应分为两相，上层水相含质粒DNA，下层油状相含内毒素。
9．将含质粒DNA的上层水相转移至新管，弃下层油状相，注意不要吸入油状相。重复抽提三次，即重复步骤7-9三次。
10．在得到的上清中加入等体积的结合液，再加入等体积的无水乙醇，混匀（上清：结合液：无水乙醇＝1：1：1）
11．玻璃奶摇匀。取20ul混匀的玻璃奶加入上面的混合液中，混匀。室温放置5分钟，期间颠倒2次。
12．10000转/分钟离心1分钟，倒掉上清；沉淀加入1ml 70%乙醇，振荡混匀，10000转/分钟离心1分钟，去上清，70%乙醇重复洗一次，再用无水乙醇洗一次。去上清，再次离心2分钟，用小吸头吸去上清。
13．室温放置10分钟（如果为大提，请延长放置时间到30分钟，此步为去除残余酒精，以免影响下游实验），加入30－50ulTE缓冲液混匀溶解，55℃水浴5分钟。离心，取上清转移到一新的离心管中。此为所提质粒。
14．电泳或者其他方法检测，进入下游实验。